Ověření efektu autoklávové sterilizace

Jedním ze základních laboratorních nástrojů v mikrobiologické laboratoři je sterilizátor, přičemž nejčastěji používaným typem jsou autoklávy. Podle GB 4789.1-2016 by mělo být laboratorní zařízení pravidelně kontrolováno a/nebo kalibrováno (s vhodným označováním), udržováno a obsluhováno, aby se zajistila provozní výkon a bezpečnost. Ale váš sterilizátor podstupuje podobné inspekce? Pokud je taková ověření vyžadována, jak by mělo být provedeno?

Dnes shrneme klíčové aspekty validace účinnosti sterilizace pro autoklávy.

Mezi běžné metody ověřování účinnosti sterilizace autoklávové patří metoda chemického indikátoru, metoda teploměru pevného bodu, metoda sonda teploty samostatně a metoda biologického indikátoru. Principy těchto metod jsou podobné, primárně se zaměřují na ověření, zda teplota uvnitř sterilizátoru dosáhne požadované úrovně během sterilizace. V závislosti na konkrétních podmínkách laboratoře lze pro ověření vybrat jednu nebo více metod.

1. Metoda chemického indikátoru
Princip: Chemické ukazatele podléhají změně nebo deformaci barvy, když jsou vystaveny specifické teplotě a trvání, což umožňuje posouzení, zda byly splněny sterilizační parametry.

Běžně používaným indikátorem v laboratořích je 3M indikátorová páska, která mění barvu před a po sterilizaci, aby se naznačovala účinnost. Tato páska je vyrobena z chemikálií citlivých na teplo a látky vyvinuté barvy vytištěné v pruzích na speciální lepicí pásky. Páska by měla být aplikována na vnější stranu balíčku, s minimální délkou 5 cm a pevně stisknuto pro lepší přilnavost a těsnění. Po sterilizaci při 121 ° C po dobu 20 minut nebo 130 ° C po dobu 4 minut se diagonální bílé pruhy na pásku zcela zčernají. Pokud je změna barvy nerovnoměrná nebo neúplná, nemusí balíček splnit podmínky sterilizace.

2. Metoda teploměru pevného bodu
Princip: Tato metoda používá rtuťový teploměr, který zachovává nejvyšší dosaženou teplotu, podobně jako tradiční klinický teploměr. Pomáhá určit maximální teplotu dosaženou uvnitř autoklávu během sterilizace.

Pro ověření je teploměr rtuti umístěn do velké kuželové baňky naplněné vodou. Během sterilizace je baňka umístěna na horních i dolních částech autoklávu. Po sterilizaci je odečtování teploměru kontrolováno proti požadované teplotě. Tato metoda však ověřuje pouze teplotu a nepotvrzuje, zda doba trvání sterilizace byla dostatečná, což z něj činí nejzákladnější standard pro validaci autoklávu.

3. Metoda teplotní sondy
Princip: Tato metoda využívá vlastnosti tání a rekrystalizace určitých chemikálií, když je vystavena teplu. Utěsněním těchto chemikálií uvnitř malých skleněných zkumavek a jejich umístěním do autoklávu může tvorba krystalu po sterilizaci naznačit, zda bylo dosaženo požadované teploty.

Běžně používaným činidlem je kyselina benzoová, která má bod tání 121–123 ° C, což úzce odpovídá požadované sterilizační teplotě. Během sterilizace je pevná kyselina benzoová utěsněna v malé skleněné trubici a umístěna uvnitř autoklávu. Po procesu je zkoumána krystalová struktura kyseliny benzoové, aby se zjistilo, zda bylo dosaženo požadované teploty.

Stejně jako metoda teploměru pevného bodu, tento přístup označuje pouze teplotu a nemůže potvrdit, zda doba trvání sterilizace stačila.

4. Metoda biologického indikátoru
Princip: Tato metoda používá nepatogenní spory Geobacillus stearothermophilus jako indikátorové organismy k posouzení účinnosti sterilizace tepla. Tyto spóry jsou vysoce odolné vůči teplu a mají tepelný odpor podobný sporákům Clostridium botulinum, což z nich činí spolehlivý reference pro vyhodnocení, zda autokláce splňuje požadavky na sterilizaci.

Biologické ukazatele přicházejí ve třech formách:

Suspenze spór
Spórové proužky
Spórové proužky kombinované s kultivačním médiem (biologické indikátorové trubice)
Biologické ukazatele jsou obvykle umístěny na pěti místech uvnitř sterilizační komory:

Nižší úroveň: přední, střední a záda
Horní úroveň: Střed
Po sterilizaci jsou indikátory inokulovány do peptonové vody bromocresol fialové glukózy a inkubovány při 55–60 ° C po dobu 2–7 dnů:

Pokud kultivační médium zůstává jasné a nezměněno barvy, byly spóry zabito, což ukazuje na účinnou sterilizaci.
Pokud se médium zvětrá a zakalená, spory přežily, což znamená, že proces sterilizace byl neúčinný.
Stejná metoda validace platí jak pro pozastavení spór, tak pro proužky spór.

Mnoho laboratoří také používá komerční biologické ukazatele, které fungují podobně jako zavěšení a proužky spór. Tyto zkumavky obsahují spory G. stearothermophilus spolu se skleněným ampule kultivačního média. Po autoklávosti je skleněný ampule uvnitř trubice rozdrcen, aby uvolnil kultivační médium, a trubice je inkubována při 56 ° C, s pozitivní kontrolou.

Pokud byla sterilizace neúčinná, růst životaschopné spóry a změní vývar žlutou.
Pokud byla sterilizace úspěšná, spory jsou inaktivovány a vývar zůstává fialový.
Frekvence ověření autoklávu
V současné době neexistují žádné přísné regulační standardy definující, jak často musí být autoklávové ověřeny. Laboratoře by však měly stanovit svůj vlastní plán validace a přísně dodržovat ho.

Pro snadnější provoz a spolehlivou validaci se vysoce doporučují chemické indikátorové pásky a biologické indikátory. Tyto metody jsou uživatelsky přívětivé a poskytují komplexní hodnocení účinnosti sterilizace.

Klíčové úvahy pro autoklávování
(Některé plně automatizované importované autoklávy nemusí vyžadovat manuální odvzdušňování)

Při použití autoklávu je nezbytné odstranit studený vzduch z komory při zavádění páry. Výfukový odvětrávání by měl zůstat otevřený, dokud nebude veškerý studený vzduch vyloučen, což zajistí rovnoměrné rozdělení teploty uvnitř.

Pokud zůstane uvnitř komory nějaký vzduch, může měřič tlaku naznačovat správný tlak, ale skutečná teplota bude nižší, než se očekávalo. Čím více zbytkového vzduchu, tím větší je nesoulad, což vede k neúplné sterilizaci.

(Pro ty, kteří se setkávají s vzduchovými bublinami v malých zkumavkách při sterilizaci fermentačního média, zkuste zvýšit evakuaci vzduchu, aby se zlepšila výsledky.)